BULGARIAN ACADEMY OF SCIENCES INSTITUTE OF NVROBIOLOGIYA ZLATINA PETROVA Nenchovska studiază efectul hormonului melatonină asupra modificărilor comportamentale și biochimice, epileptogeneză INCIDENTALĂ în kainat MODEL lobul temporal epilepsie A la T O R E F E R A T disertare științifică Farmacie DOCTORAT științe de specialitate Farmacie DOCTORAT științe universitare și chimioterapie) (cod 03.01.24) Domeniu: Neurobiologie comportamentală Supervizor: Prof. Dr. Yana Chekalarova Recenzori oficiali: Prof. Dr. Iren Belcheva, MD, dr. Hristo Gagov SOFIA, 2019

descărcare

Disertația este scrisă pe 132 de pagini și este ilustrată cu 30 de cifre, dintre care 27 sunt duble, 1 tabel și 1 diagramă. Lista bibliografică include 256 de surse de literatură. Disertația a fost aprobată și dirijată pentru apărarea unui seminar științific în domeniul Neurobiologiei Comportamentale la Institutul de Neurobiologie - BAS, desfășurat pe 16.05.2019. Disertația vizează apărarea în fața unui juriu științific format din: prof. Dr. Iren Belcheva, MD, MD - Institutul de Neurobiologie, BAS Prof. dr. Hristo Gagov, Facultatea de Biologie, Kliment Ohridski Prof. dr. Rositsa Zamfirova -Mitova - Institutul de Neurobiologie, BAS Conf. Dr. Rumen Nikolov, MD - Universitatea de Medicină, Sofia Conf. Dr. Pavlina Gateva, MD - Universitatea de Medicină, Sofia Membrii de rezervă: Conf. Dr. Katerina Stambolieva, Institutul de Neurobiologie, BAS Prof. Dr. Katerina Georgieva, MD - Universitatea de Medicină, Plovdiv Apărarea disertației va avea loc în data de 30.09.2019 la ora 11 dimineața în sala de consiliu a Institutului de Neurobiologie - BAS, Acad. Georgi Bonchev Str. Bl. 23, fl. 2. Materialele de apărare sunt disponibile în biroul Institutului de Neurobiologie - BAS, str. Acad. Georgi Bonchev, Bl. 23, fl. 2.

MULȚUMIRI Aș dori să-mi exprim recunoștința și aprecierea sinceră către supraveghetorul meu prof. Dr. Yana Chekalarova pentru sprijinul și dedicația nemărginită, pentru sfaturile și îndrumările de neprețuit, pentru răbdarea și sfaturile cu privire la timpul de lucru experimental și procesarea rezultatelor pentru oportunitățile oferite mie și votul meu de încredere. Vă mulțumesc că m-ați introdus în lumea științei și m-ați ajutat să învăț metodologii valoroase! Îmi exprim marea mea recunoștință și apreciere colegilor de la Institutul de Neurobiologie - conf. Dr. Daniela Pehlivanova, asistent universitar Lydia Kortenska, asistent profesor Rumyana Mitreva, dr. Natasha Ivanova pentru înțelegere, sprijin și asistență în desfășurarea activității . Mulțumiri speciale conf. Dr. Dimitrinka Atanasova pentru asistență în cercetarea morfologică și sfaturi valoroase și pași de bază în domeniul perfuziei transcardice. Aș dori, de asemenea, să mulțumesc conf. Dr. Milena Atanasova de la Universitatea de Medicină din Pleven pentru asistența acordată în efectuarea cercetării biochimice. Mulțumesc familiei mele pentru sprijinul și credința lor necondiționată!

ABREVIERI UTILIZATE 5-HT EPM FST GD HPLC KARs Mel OF PB Pir RAM RNS ROS SHR SOD TE Veh WKY EEG ESKA SPGP SHYA CNS serotonina crescută labirint/elevat plus labirint înot forțat test girus dentat cromatografie lichidă de înaltă performanță kainat receptori melatonină deschis tampon fosfat de câmp piriform scoarță braț radial labirint specii de azot reactiv specii de azot reactiv specii/oxigen reactiv specii spontan hipertensivi șobolani superoxid dismutază lob temporal epilepsie vehicul Wistar Kyoto electroencefalogramă status epilepticus acid kainic convulsii recurente spontane nucleu suprachiasmatic sistem nervos central

CUPRINS 1. INTRODUCERE. 8 2. SCOP ȘI SARCINI. 10 3. MATERIAL ȘI METODE. 10 3.1. Animale experimentale. 10 3.1.1. Rasa Wistar. 11 3.1.2. Rasa șobolanilor hipertensivi spontan (SHR). 11 3.2. Formularea experimentală și introducerea substanțelor 11 3.3. Procedura chirurgicală pentru implantarea electrodului. 12 3.4. Inducerea statusului epilepticus prin injectarea acidului cainic. 12 3.5. Înregistrare video și EEG a activității epileptiforme spontane. 13 3.6. Teste comportamentale. 13 3.6.1. Test pentru preferința de citire pentru soluții dulci - comportament depresiv (anhedonia). 13 3.6.2. Test de câmp deschis. 14 3.6.3. Labirint cruce ridicat. 14 3.6.4. Test de depresie - înot forțat. 14 3.6.5. Test pentru examinarea labirintului parametric spațial dependent de hipocampus cu opt umeri. 14 3.7. Metodă histologică pentru studiul pierderii neuronale în structurile creierului (hipocampus, girusul girus dentatus și cortexul piriform). 15 3.8. Cromatografie lichidă de înaltă performanță. 16 3.9. Metode biochimice (luând în considerare peroxidarea lipidelor și activitatea enzimei superoxid dismutază). 16 3.9.1. Măsurarea peroxidării lipidelor. 17 3.9.2. Măsurarea superoxidului dismutazei citosolică. 17 3.10. Prelucrare și analiză statistică. 17 5

8.2. Lista participărilor și rapoartelor științifice pe tema disertației. 60 8.3.Premii și onoruri . 62 Vara. 63 1. Scopuri. 64 2. Sarcini. 64 3. Materiale și metode. 64 3.1. Animale. 64 3.2. Grupuri experimentale și tratament medicamentos 64 3.3. Interventie chirurgicala. 64 3.4. Inducerea statusului epileptic cu acid kainic . 65 3.5. Monitorizarea video și EEG a convulsiilor recurente spontane . 65 3.6. Teste comportamentale. 65 3.6.1. Test de preferință zaharoză. 65 3.6.2. Test de câmp deschis. 66 3.6.3. Test de labirint ridicat-plus . 66 3.6.4. Test de înot forțat (FST) . 66 3.6.5. Testul labirintului brațului radial (RAM) . 66 3.7. Histologie. 66 3.8. Cromatografie lichidă de înaltă performanță. 67 3.9. Metode biochimice. 67 3.9.1. Măsurarea peroxidării lipidelor 68 3.9.2. Măsurarea superoxidului dismutazei citosolică. 68 3.10. Analize statistice. 68 4. Rezultatul și discuția. 68 7

IBN, BAS (înregistrare FWA 00003059 US Department of Health and Human Services). 3.1.1. Rasa Wistar Șobolanii Wistar sunt o linie obținută prin încrucișarea șobolanilor albini aparținând speciei Rattus norvegicus. utilizat în cercetarea biologică și medicală. 3.1.2. Rasa de șobolan SHR hipertensivă spontan a fost considerată un model animal de hipertensiune esențială și a fost utilizată pentru a studia bolile cardiovasculare, precum și un model de boală cu hiperactivitate și deficit de atenție. Metode in vivo 3.2. Formulare experimentală și administrare de substanțe Animalele au fost împărțite în patru grupe principale: C-veh (martor, tratat cu solvent, n = 20); C-mel (grup de control tratat cu melatonină, n = 20); KA-veh (grup cu epilepsie n = 20); KA-mel (grup de epilepsie tratată cu melatonină, n = 20). Tratamentul cu melatonină (Sigma-Aldrich, Bulgaria) începe la trei ore după începerea UE, la o doză de 10 mg/kg, pentru o perioadă de 8 săptămâni. Grupurile de control au fost tratate cu apă de la robinet. Pentru testarea stresului oxidativ, tratamentul cu melatonină a fost efectuat folosind pompe Alzet minisomotice implantate, pentru o perioadă de 2 săptămâni înainte de UE, la o doză de 10 mg/kg/zi, la o rată de perfuzie de 0,5 µl/h. 11

Schema 3.2.1. Schema de stabilire experimentală Testele de comportament încep la aproximativ 14 zile post-UE la șobolani cu crize motorii spontane. La douăzeci de săptămâni după UE, șobolanii au fost perfuzați pentru examinarea histologică ulterioară sau decapitați prin izolarea structurilor creierului pentru analize biochimice. 3.3. Operația de implantare a electrodului Operația de implantare a electrodului cortical și hipocampal epidural pentru înregistrarea EEG se efectuează în a cincea zi după UE, sub anestezie generală, după fixarea într-un dispozitiv stereotactic (Narishige Sci. Inst. Labs, Japonia). 3.4. Inducerea statusului epilepticus prin injectarea acidului cainic Statusul epilepticus este indus de i.p. administrarea CA (Ascent Scientific, Marea Britanie) prin titrare la o doză ineficientă de 2,5-5 mg/kg în fiecare oră, conform protocolului lui Hellier și colab. (1998) cu modificări minore (Tchekalarova și colab., 2010), la o doză maximă admisibilă de până la 30 mg/kg/șobolan. Grupul de control a fost tratat cu volumul echivalent și numărul de injecții 12

Analiza variației cu trei factori a fost utilizată pentru procesarea datelor din: testul preferinței soluției dulci, testul înotului forțat, testul în câmp deschis, testul labirintului încrucișat crescut (factori: epilepsie, substanță, faza de lumină întunecată) și testul pentru memoria spațială hipocampică dependentă de dependență (RAM) (factori: epilepsie, substanță, sesiune). Toate valorile cu p 9 convulsii motor/oră timp de cel puțin 3 ore). Doza de KA necesară pentru a induce UE este de 16,25 ± 5,52 mg/kg. Comportamentul observat în timpul injecției KA este însoțit de automatism facial, scuturare umedă de câine și clone de cap. Aceste răspunsuri comportamentale progresează apoi către convulsii generalizate secundare, i. clonul membrului anterior (clasa a III-a), urmat de îndreptarea membrelor posterioare (clasa a IV-a), spasme ale membrelor anterioare și pierderea echilibrului (clasa V) conform unei scale modificate Racine (1972). Înregistrările electroencefalografice în timpul convulsiilor de clasa IV/V la șobolani cu electrozi implantați au arătat vârfuri sporadice, vârf post-descărcare, activitate epileptiformă caracterizată prin amplitudine mare (Fig. 4.1.1. A, B-Ab, BB). 18

A Wistar B SHR FIG. 4.1.1. Controlați înregistrările EEG în Wistar (A) și SHR (B) ale cortexului parietal stâng și drept (Cx-L și Cx-R) și hipocampul stâng și drept (Hip-L și Hip-R) la doi șobolani din grupul epileptic KA-veh) - A și din grupul epileptic tratat cu melatonină (KA-mel) - B; Aa, înainte de KA: desincronizare în înregistrare EEG - fază activă; Ab, în ​​timpul UE provocat de KA (faza acută); Ab, în ​​faza latentă: activitate EEG subconvulsivă (unde de vârf și unde theta); Ag, fază cronică: crize epileptice spontane în timpul înregistrării EEG, însoțite de modificări comportamentale și motorii. Activitatea EEG tipică (amplitudine ridicată, unde de frecvență joasă și vârfuri ascuțite) raportate în a patra lună după CE indusă de CA/motor, convulsii recurente în grupul epileptic (KA-veh), în perioada de observație. B: Ba, înainte de KA: tulburări EEG (fază activă) în grupul epileptic tratat cu melatonină (KA-mel); BB, în faza acută a UE; în faza latentă: unde delta/teta de amplitudine mare, fără unde de înaltă frecvență; Bg, fază cronică, EEG în a 4-a lună. 19