Universitatea de Medicină din Sofia, Facultatea de Medicină Departamentul de Farmacologie și Toxicologie Str. Zdravle 2, 1431 Sofia, (02) 9172 714, tel./fax 9172 620 Dr. Lyudmil Kalistratov Lazarov INVESTIGAȚII FARMACOLOGICE ȘI CLINICE ASUPRA disertației pentru obținerea unei studii științifice și educaționale doctor în domeniul învățământului superior 7. Asistență medicală și sport, domeniul profesional 7.1. Medicină și specialitate științifică Farmacologie (inclusiv farmacocinetică și chimioterapie) Supervizori: Prof. Dr. Nadka Boyadzhieva, MD, MD Departamentul de farmacologie și toxicologie, MF, MU Sofia Conf. Univ. Dr. Emil Gachev, MD Șeful Departamentului Clinic Farmacologie și terapie, MF, MU Sofia Recenzori oficiali: conf. Dr. Rumen Pavlov Nikolov, conf. Dr. Ivan Todorov Lambev, MD Sofia 2017

word

Disertația este formată din 112 pagini și este ilustrată cu 19 figuri și 6 tabele. Bibliografia cuprinde 208 de surse literare, dintre care 6 în chirilică și 202 în latină. Apărarea publică oficială va avea loc pe 14.09. 2017 de la ora 15.45, în sala 2 a Centrului Universitar Preclinic MF Sofia, str. Zdrave 2, conform art. 76 și 77 din Regulamentul privind termenii și condițiile pentru obținerea de diplome științifice și ocuparea unor funcții academice la Universitatea de Medicină din Sofia și în baza Ordinului RC36-1103/06.07.17 al Rectorului MU Sofia, în fața unui juriu științific compus din: Președinte: Prof. Dr. Nadka Ivanova Boyadzhieva, MD, MD Membri: 1. Conf. dr. Rumen Pavlov Nikolov, MD 2. Prof. dr. Vitan Dakov Vlahov, MD 3. Conf. dr. Ivan Todorov Lambev, MD 4 conf. Univ. Dr. Maria Delcheva Zhelyazkova-Savova, MD Membrii de rezervă: 1. conf. Univ. Dr. Pavlina Angelova Gateva, MD 2. Conf. Univ. Dr. Maria Ganeva Ganeva, MD Materialele de apărare sunt disponibile celor interesați de Departamentul de Farmacologie și Toxicologie al Facultății de Medicină, Universitatea de Medicină din Sofia și sunt publicate pe site-ul web al MU Sofia. 2

ABREVIERI ABREVIATE În analiza impedanței bioelectrice BIA chirilice diabet zaharat diabet zaharat indicele de masă corporală NGG afectat glucoză la jeun Efecte secundare GLRA OGTT test de toleranță la glucoză oral Indicele IMC al t.m. (IMC) BMR metabolism bazal (metabolism bazal) SSC colecistochinină CID investigație clinică zi CFU colonii formând unități CRP proteină reactivă C DPP-4 dipeptidil peptidază-4 ECW apă extracelulară GLP peptidă asemănătoare glucagonului ELISA imunosorbent imunosorbent liber legat de acid imunosorbent FFM masă fără grăsimi FMT transplant de microflorei fecale FTO Masă grasă și proteine ​​asociate obezității HbA 1C hemoglobină glicată HDL lipoproteină cu densitate mare HOMA evaluare model homeostatic Il-1 interleukină 1 inos indicativ NU sintază LCD dietă hipocalorică NAFLD boală grasă nealcoolică NIRDIABO INTERVENȚII NONFARMACOLOGICE PENTRU REDUCEREA RISCULUI DIABETULUI ÎN OAMENII Celulelor NK cu celule NK ucigași naturali 3

NO oxid de azot NOS oxid de azot sintază QUICKI cantitativ indicativ de verificare a sensibilității insulinei PPARG Peroxizom receptor activat de proliferator gamma RYGB Roux-en-Y Bypass gastric SCFAs Acizi grași cu lanț scurt T2DM diabet zaharat tip 2 TBW apă totală a corpului TCF7L2 Factor de transcripție 7-Like 2 TNF-α factor de necroză tumorală-alfa TZD tiazolidindionele UCP1 proteină nelegată 1 VFR rating de grăsime viscerală VLCD dietă cu conținut scăzut de calorii 4

CUPRINS ABREVIERI UTILIZATE. 1. INTRODUCERE. 3 7 2. SCOP ȘI SARCINI. 10 2.1. Scop. 10 2.2. Sarcini. 10 2.2.1. Sarcini experimentale farmacologice 2.2.2. Sarcini de cercetare clinică. 3. MATERIALE ȘI METODE. 10 11 12 3.1. Materiale. 12 3.1.1. Animale experimentale. 12 3.1.2 Medii farmacologice. 12 3.1.3. Agenți non-farmacologici. 13 3.2. Metode pentru studierea indicatorilor metabolismului și metabolismului glucidic. 14 3.2.1. Metode clinice și de laborator. 14 3.2.2. Metode ELISA.15 3.2.3. Metode de evaluare a obezității 15 3.2.4. Metoda de determinare a prediabetului ... 17 3.2.5. Metode genetice. 17 3.2.6. Metode statistice de analiză.18 4. REZULTATE. 20 4.1. Experimente de laborator cu șobolani. 19 4.2. Rezultatele cercetării proiectului NIRDIABO. 23 5

5. DISCUȚIE 38 6. CONCLUZII ȘI CONTRIBUȚII. 45 6.1. Concluzii. 43 6.2. Randamente. 44 7. Publicații și participare la forumuri științifice. 47 7.1. Publicații. 45 7.2. Participarea la forumuri științifice. 46 8. REZUMAT. 50 6

este individuală și depinde de diverși factori (genetici, sexuali, boli concomitente, în special inflamatorii etc.). În prezenta disertație sunt studiate mai multe gene la bărbați și femei cu prediabet și obezitate dovedite. S-au efectuat studii genetice asupra variațiilor a 3 gene (TCF7L2, PPARG, FTO). Condițiile preliminare pentru selectarea acestor gene sunt următoarele: TCF7L2: TCF7L2 a fost descrisă recent ca o genă de risc principal pentru DM2. Acest produs genetic aparține grupului de factori de transcripție implicați în homeostazia glicemiei. PPARG: Receptorii activați cu proliferatori ai peroxisomilor (PPAR) sunt o superfamilie hormonală nucleară a factorilor de transcripție activați cu ligand. PPARg2 este specific țesutului adipos, unde joacă un rol principal în reglarea diferențierii adipocitelor. Următoarea substituție de aminoacizi Pro12Ala va fi investigată. FTO: exprimat în principal în hipotalamus. S-a sugerat că joacă un rol în reglarea homeostaziei energetice (Fredriksson și colab., 2008; Stratigopoulos și colab., 2008), demetilarea acidului nucleic și reglarea țesutului adipos prin controlul lipolizei (Wahlen și colab., 2008). 9

2. SCOP ȘI SARCINI 2.1. Obiectiv: Studierea mecanismelor prediabetului prin studii experimentale și clinice. 2.2. Sarcini 2.2.1. Sarcini experimentale farmacologice 1. Pentru a crea modele experimentale de rezistență la insulină la șobolani Wistar masculi maturi sexual utilizând două abordări: a) fructoză și b) obezitate. 2. Să studieze modificările metabolismului glucidic și al grăsimilor cu modelele dezvoltate și să determine efectul farmacologic al ELBIVITului probiotic asupra indicatorilor indicați. 3. Să studieze efectele melatoninei asupra șobolanilor masculi cu modele de rezistență la insulină și obezitate și să determine indicatorii t.m. și metabolismul carbohidraților. 4. Pentru a determina efectele unei substanțe certificate de laborator derivate din planta Tribulus terrestris asupra șobolanilor masculi cu un model de rezistență la insulină și obezitate. 10

2.2.2. Sarcini de cercetare clinică 1. Pentru a determina efectele dietei cu conținut scăzut de calorii, combinate cu aportul de probiotice ELBIVIT, asupra distribuției grăsimilor în organism, a grăsimilor totale și a acumulării acestora (indicatori de impedanță biometrică), indicatori antropometrici ai participanților voluntari în proiectul de cercetare.NIRDIABO a ambelor sexe cu vârste cuprinse între 20 și 70 de ani cu prediabet și obezitate. 2. Determinarea efectelor unei diete cu conținut scăzut de calorii, combinată cu aportul probiotic ELBIVIT, asupra indicatorilor metabolismului carbohidraților (glucoză în post și OGTT) și metabolismului grăsimilor (colesterol, colesterol-hdl, colesterol-goodl în trei, trei ) NIRDIABO de ambele sexe cu vârsta cuprinsă între 20 și 70 de ani cu prediabet și obezitate. 3. Pentru a determina efectele dietei hipocalorice și ale ELBIVITului probiotic asupra indicelui NOMA și a nivelurilor serice de citokine din sângele voluntarilor care participă la proiectul NIRDIABO la ambele sexe cu vârsta cuprinsă între 20 și 70 de ani cu prediabet și obezitate. 4. Studierea parametrilor principali ai stării genetice a voluntarilor cu prediabete (afectare a glicemiei în repaus alimentar și/sau toleranță redusă la glucoză) și obezitate (BMI> 25 kg/m 2), prin identificarea a trei gene asociate cu obezitatea și prediabetul (TCF7L2, PPARG, FTO). 11

Curentul de înaltă frecvență trece prin membrana celulară și rezistența măsurată reflectă apa totală din corp. Valorile măsurate ale frecvenței joase și înalte sunt utilizate pentru a calcula apa extracelulară (ECW) și apa corporală totală (TBW). Aceste componente sunt utilizate pentru calcularea țesutului adipos (FM) și a țesutului ne-adipos (FFM). BIA este o metodă ușoară, neinvazivă, relativ ieftină, fără expunere la radiații ionizante, care poate fi utilizată la indivizi sănătoși și pacienți cronici cu echilibru stabil al apei și al electroliților. Dispozitivul de bioimpedanță utilizat a fost Tanita BC-420 MA. 3.2.4 Metoda de determinare a prediabetului Metode de determinare a profilului de zahăr din sânge sau a sarcinii de glucoză a indicelui HOMA HOMA sau model homeostatic pentru evaluarea sensibilității la insulină este un indice de determinare a sensibilității celulelor la insulină, bazat pe glicemia de post și insulina de post conform unei formule standard: HOMA-IR = glucoză (mmol/l) * insulină (mu/l ) /22.5 Valorile de referință sunt după cum urmează: Normal HOMA-IR 5.0 3.2.5. Metode genetice Amplificarea prin reacție în lanț a polimerazei (PCR) a fragmentelor specifice de ADN genomic de 17

gene și polimorfisme selectate. În reacția de amplificare este implicată o ADN polimerază ADN dependentă termostabil, care efectuează reacția polimerazei într-un mediu tampon cu o concentrație adecvată de ioni Mg 2+ și în prezența nucleotidelor libere. Reacția de amplificare se efectuează într-un aparat PCR care menține temperaturile specificate necesare pentru implementarea secvențială a fiecărei etape a denaturării reacției PCR, hibridizarea primerilor (aniling), sinteza ADN-ului. 3.2.6. Metode statistice Compararea parametrilor clinici (IMC, HOMA, greutate, talie,% grăsime, VFR) în prima și a doua măsurătoare Înainte de efectuarea testelor statistice, datele au fost revizuite pentru valorile lipsă, înregistrările eronate și alte probleme potențiale. Datele din ambele măsurători (CID1 și CID2) au fost analizate împreună și apoi împărțite la sex. După ștergerea datelor, a fost efectuat un test Student unilateral pentru a compara grupurile de probe pereche. A fost ales un test unilateral datorită direcției așteptate anterior a diferențelor dintre grupuri, și anume spre reducerea indicilor considerați și a indicatorilor clinici și fizici. Valoarea standard a p 70 a fost acceptată ca prag de semnificație 23

Bărbați/Total 31 4 6 41 Vârsta 25-40 ani 10 2 3 15 Vârsta 41-60 ani 13 2 2 17 Vârsta 61-70 ani 8 0 1 9 Figura 3. Greutatea totală (bărbați și femei) a participanților la NIRDIABO la CID 1 înainte de dieta de două luni cu conținut scăzut de calorii + probiotic și în CID 2 după finalizarea dietei de două luni cu conținut scăzut de calorii + probiotic. Vizita 6 este vizita CID 2, când medicul a determinat indicatorii de greutate, starea generală de sănătate și a măsurat participantul cu un dispozitiv Tanita. Datele sunt prezentate ca medie ± eroare standard. Concluzie: Participanții ambelor sexe au pierdut o greutate semnificativă statistic după o dietă de două luni, cu o dietă hipocalorică și probiotice. Toți au obținut 5% pierderea în greutate și 40% din 25

participanții au obținut peste 5% pierderea în greutate (respectiv de la 8 la 14%). Analiza rezultatelor a arătat că o rată mai mare de scădere în greutate a fost observată la acești participanți cu greutate corporală mai mare. Greutatea corporală a bărbaților care participă la proiectul NIRDIABO a fost comparată cu CID 1 înainte de dieta de două luni cu conținut scăzut de calorii + probiotic și cu CID 2 după finalizarea dietei de două luni cu conținut scăzut de calorii + probiotic. Concluzie pentru bărbați: Greutatea bărbaților care participă la NIRDIABO a fost statistic semnificativ redusă (p 25) Fig.11. Distribuția genotipică a receptorului activat cu proliferator Peroxisom Gamma (PPARG) la pacienții bulgari cu IMC ridicat (> 25 kg/m 2) (CC: 82,6%, CG: 16,4%, GG: 1%) Distribuția genotipului la subiecții europeni de control sănătos Fig. 12. Distribuția genotipică a receptorului activat cu proliferator Peroxisom Gamma (PPARG) în rândul europenilor sănătoși (CC: 86%, CG: 13%, GG: 35