ACADEMIA BULGARIANĂ DE ȘTIINȚE Institutul de Microbiologie Stefan Angelov Irina Marinova gata imunoreglator PROPRIETĂȚI DE EXPLORARE ALE SELECȚIEI ȘI tulpini de bacterii lactice pentru produse cu beneficii pentru sănătate Vara autorului pentru acordarea diplomei științifice și științifice Cod medic: 010 612 Tutor: Chl.- ​​homer . Hristo Naidenski, dr. Prof. Dr. Zhechko Dimitrov SOFIA 2019

irina

Disertația conține 170 de pagini, care conțin 42 de figuri și 25 de tabele. Au fost utilizate 331 de surse literare, dintre care 9 au fost de autori bulgari. Autor: Irina Marinova Gotova Disertația este discutată și vizează apărarea curriculumului extins - D 2

Lista abrevierilor utilizate GIT tractul gastrointestinal ICD bacterii lactice CFU Unitatea de formare a coloniei FAO Organizația pentru Alimentație și Agricultură OMS Organizația Mondială a Sănătății GRAS În general considerată ca sigură QPS Calitatea a fost introdusă de EFSA, similar cu sistemul GRAS pentru evaluarea siguranței microorganismelor alimente și furaje PCR Polimerază Reacție în lanț ROS Oxigen reactiv Specii AK aminoacid ECM matrice extracelulară IC sistem imunitar CP crioprotector Mediu nutritiv HS Celulele prezentatoare de antigen APC BP - Peptide bioactive ACE Sulfură Angiotensină dismutază IL- Interleukină IBD - Boală inflamatorie intestinală TNF-α Tumor Factor alfa TGF-β Factor de creștere transformant beta IFN - Interferon TRFLP Polimorfism de lungime a fragmentului de restricție terminală ELISA Analize imunosorbente legate de enzime 3

OBIECTIV ȘI SARCINI Obiectiv: Investigarea proprietăților adezive și imunoreglatorii ale ICD. Selectarea tulpinilor pentru dezvoltarea probioticelor liofilizate. Sarcini: 1. Identificarea apartenenței speciei și identitatea tulpinii izolatelor ICD prin metode genetice moderne 2. Adaptarea metodei TRFLP pentru determinarea necultivării grupelor bacteriene de bază din microflora intestinală umană. 3. Studiul capacității adezive a ICD în scopul selecției inițiale a tulpinilor probiotice și stabilirea naturii factorilor adezivi pentru tulpinile cele mai puternic aderente. Studiul expresiei genelor bacteriene asociate cu adezivitatea utilizând tehnici PCR în timp real. 4. Evaluarea citokinelor asociate cu tipul respectiv de răspuns imun (mediat celular, umoral și inflamator) indus de izolatele studiate. Selectarea tulpinilor cu potențialul de a afecta răspunsul imun în macroorganism. 5. Izolarea și purificarea peptidelor bioactive eliberate din ICD capabile să inducă citokine semnificativ diferite. 6. Efectuarea studiilor clinice ale unei tulpini probiotice selectate. 7. Elaborarea unei scheme tehnologice pentru producerea preparatelor polibacteriene, sinbiotice liofilizate. 5

MATERIALE ȘI METODE 1. Microorganisme și linii celulare 1.1. Tulpini de referință 1.2. Studiu izolate 1.3. Linii celulare și splenocite 2. Medii și tampoane 2.1. Medii de cultură bacteriene 2.2. Linia celulară și mediul de cultură a splenocitelor 2.3. Tampoane 3. Amestecuri crioprotectoare 4. Metode moleculare de identificare și tipare 4.1. Tiparea nivelului de gen - PCR specific pentru sex 4.2. Tastarea la nivel de tip 4.3. Tastarea nivelului de tulpină - Electroforeza pulsului 4.4. Metoda necultivării pentru determinarea diversității bacteriene în matrici complexe - TRFLP 5. Aderența și bazele moleculare ale aderenței 5.1. Evaluarea capacității adezive a tulpinilor ICD la liniile celulare epiteliale 5.2. Determinarea naturii factorilor adezivi 5.3. Determinarea factorilor de aderență a proteinelor de suprafață 5.4. Metode PCR în timp real pentru determinarea expresiei genelor structurale importante pentru aderența bacteriană la mucusul uman 6. Cultivarea și menținerea liniilor celulare pentru evaluarea inducției citokinelor 6.1. Liniile celulare epiteliale umane - CaCo-2 și HT-29 6.2. Linia de celule umane monocite - THP1 6

6.3. Splenocite 7. Evaluarea inducerii citokinelor 7.1. Evaluarea inducției peptidei de semnal TNF-α 7.2. Evaluarea inducției peptidei de semnal IL-8 7.3. Evaluarea inducției peptidei semnal IL-6 7.4. Evaluarea inducției peptidei semnal IL-10 7.5. Evaluarea inducției peptidei semnal TGF-β 7.6. Evaluarea inducției peptidelor de semnal IFN-γ 7.7. Evaluarea inducției peptidei semnal IL-1 7.8. Evaluarea inducției peptidei semnal IL-4 7.9. Evaluarea inducerii diferitelor citokine de către peptidele bioactive eliberate de ICD 7.9.1. Pregătirea brânzeturilor model de laborator 7.9.2. Determinarea activității proteolitice totale 7.9.3. Pregătirea probei pentru analiza cromatografică 7.9.4. Separarea inițială a fazei inverse a unui sistem cromatografic lichid cu un colector fracțional 7.9.5. Separarea secundară a unui sistem cromatografic lichid cu un colector fracțional 7.9.6. Evaluarea inducției citokinelor prin fracțiuni peptidice 8. Protocol pentru efectuarea testelor clinice 9. Partea tehnologică 9.1. Condiții pentru efectuarea proceselor de fermentare 9.2. Condiții de liofilizare 7

Figura 2. ARDRA a izolatelor și tulpinilor de referință după hidroliza ADN-ului cu enzima Hae III, unde: Tulpinile de referință sunt indicate prin litere: b- L. bulgaricus, l- L. lactis, c- L. casei, rh- L. rhamnosus, p- L. plantarum, re- L. reuteri, h- L. helveticus, a- L. acidophilus, g- L. gasseri; Izolatele Lactobacillus neidentificate sunt indicate prin numere: 1- KM053, 2- KM058, 3- KM120, 4- KM144, 5- KM181, 6- DS012, 7- DS040, 8- DS048, 9- DS197, 10- DS200, 11- DS031, 12- In004, 13- In007, 14- In008, 15- In0011, 16- In002a, 17- In002b, 18- In009, 19- In215, 20- In012; Marker M-molecular 100 bp. După cum se poate vedea în FIG. 2, lactobacili care nu se disting printr-o singură reacție cu enzima Hae III sunt L. helveticus, L. acidophilus, dar inclusiv specia L. crispatus, care nu este prezentată în fotografie. Aceste trei specii rămân indistincte chiar și după administrarea enzimei Msp I. În acest caz, se face o restricție cu enzima Eco RI, ceea ce duce la un profil specific de L. helveticus (fragmente 0,8 și 0,7 kbp). Cu toate acestea, perechea de profiluri a speciilor L. acidophilus și L. crispatus, care se pot distinge prin PCR cu grunduri specifice speciei în condițiile și grundurile specificate în partea metodologică, rămân indistincte. Alte astfel de perechi de profile nu se pot distinge chiar și cu o combinație de 10

Conținutul de GC este mai mare, se utilizează enzime care recunosc 4 baze GC dintr-un total de 6 baze în locul de tăiere. Identificarea preliminară a speciilor ajută la selectarea enzimelor de restricție, iar condițiile de separare în PFGE sunt foarte dependente de conținutul de GC al ADN-ului bacterian. Secțiunea Materiale și metode enumeră enzimele de restricție utilizate și condițiile pentru conducerea PFGE în funcție de specia tulpinilor testate. PFGE are marele avantaj față de alte metode de genotipare, cu posibilitatea ca fragmentele care alcătuiesc întregul genom să fie prezentate într-un singur gel. Acesta este unul dintre factorii puterii discriminatorii excepționale a PFGE. Figura următoare prezintă o fotografie a unui gel pe care se aplică izolatele de brânză specificate, pentru a verifica unicitatea fiecărei tulpini dintre ele și a celor existente în colecția de LB Bulgaricum. Figura 4. Analiza PFGE a tulpinilor de L. helveticus folosind enzima Apa I: pe benzile 1-12 ale tulpinilor de L. helveticus din colecția de LBI Bulgaricum folosită pentru comparație; Izolații de cale necunoscute, respectiv: 13) - DS012, 14) - DS040, 15) - DS048, 16) - DS0197 și 17) - DS200; M - marker molecular al ADN-ului (50-1000 kbp). 15

grupul. Desigur, această compoziție este foarte dependentă de dieta individuală în ultimele 12-24 de ore înainte de prelevare și nu certifică posibila colonizare a anumitor tulpini, dar utilizarea sa pe termen lung ar putea duce la formarea tendințelor în impactul consumului a anumitor alimente.sau probiotice la un individ. 2. ADEZIUNEA ȘI BAZA MOLECULARĂ A ADEZIUNII 1.1. Evaluarea aderenței ICD la epiteliul intestinal Aderarea la celulele epiteliale intestinale este considerată a fi primul pas către colonizarea permanentă de către lactobacili pentru a avea un efect benefic asupra gazdei (Hynonen & Palva, 2013). Caco-2 este o linie celulară izolată de adenocarcinomul uman al colonului și una dintre aplicațiile sale se află în studiul capacității de a adera la ICD, deoarece formează un monostrat, asemănător morfologic și funcțional epiteliului intestinal (Hidalgo și colab., 1989 ). În literatura de specialitate au fost raportate numeroase tulpini care demonstrează aderența la linia celulară Caco-2, cea mai renumită tulpină probiotică L. rhamnosus GG fiind cea mai înaltă aderență (Lee și colab., 2000). Figura următoare prezintă o imagine a aderenței. Figura 6. Aderență puternică pe o singură celulă eucariotă Caco-2 a izolatului In012, care după identificare a fost identificată ca L. phlantarum. 17

exclude posibilitatea ca ionii de calciu să fie implicați în mecanismul de aderență al tulpinilor studiate Figura 7. Influența tratamentului cu soluții de tripsină, acid metaperiodic și EDTA asupra aderenței izolatelor studiate. 1.3. Determinarea factorilor de aderență a proteinelor de suprafață După stabilirea naturii proteice a factorilor de aderență în trei dintre poluanți, proteinele de suprafață implicate în aderența acestor tulpini au fost detectate. În acest scop, proteinele de suprafață au fost extrase din cele mai puternice patru tulpini adezive. Extractele de proteine ​​de suprafață au fost împărțite în două. O jumătate din extractele marcate cu o literă corespunzătoare speciei și indexului 1 nu au fost incubate cu monostrat epitelial. Cealaltă jumătate, marcată cu aceleași litere și index 2, a fost incubată cu un monostrat Caco-2. Extractele astfel preparate au fost aplicate pe căile adiacente în gel de poliacrilamidă (SDS-PAGE) și o fotografie a rezultatelor obținute este prezentată în figura următoare 8. 20

Figura 9 prezintă graficul qpcr, care prezintă liniile qpcr (cu mucină și fără mucină) ale uneia dintre cele trei gene studiate (mub), împreună cu liniile qpcr ale genei de referință GDPH. Supraexpresia semnificativă a genei mub în 0,01% mediu mucinic (linia 1) a fost ilustrată comparativ cu expresia aceleiași gene în mediu mucinic 0% (linia 4). Expresia genei GDPH fără referință nu s-a modificat semnificativ prin adăugarea de 0,01% mucină în mediu. Nivelurile de expresie ale celor 3 gene studiate au fost calculate utilizând: expresie normalizată în raport cu gena de referință GDPH și pe de altă parte - expresie relativă, corelând nivelurile de expresie în mucină și mediu fără mucină. Figura 10. Creșterea (în timp) a exprimarea a trei gene structurale pentru tulpinile L. plantarum In012 și L. gasseri In004 în mediu cu 0,01% mucină comparativ cu expresia în mediu fără mucină. În FIG. 10 este o creștere grafică a timpilor de expresie a celor trei gene selectate pentru cele două tulpini selectate de L. plantarum In012 și L. gasseri In004 în mediu adăugat de mucină în raport cu nivelul lor de expresie în mediu fără mucină, cu PCR în timp real semnale corelate relativ la cea a genei de referință. 23

Cuantificarea finală a concentrației diferitelor citokine a fost realizată prin metode imunosorbente (kituri ELISA) corespunzătoare fiecărei citokine măsurate și tipului de model de laborator (om/șoarece). Rezultatele sunt procesate statistic pentru a compila un profil de citokine și selecția ulterioară a tulpinii. Citokina proinflamatorie majoră care a fost raportată este factorul de necroză tumorală alfa peptidică semnal (TNF-α). După cum sugerează și numele, TNF-α și omologul său TNF-β au fost inițial descoperite ca peptide secretoare care induc imunitatea antitumorală (Beutler și Cerami, 1989). Sunt direct citotoxice împotriva celulelor canceroase, stimulează răspunsurile imune antitumorale din celulele imune și, atunci când sunt administrate in vivo, induc necroza hemoragică a tumorilor, dar producția crescută este dăunătoare, în special la persoanele care suferă de boli inflamatorii. Activitățile suplimentare TNF includ stimularea resorbției osoase, degradarea cartilajului și activarea celulelor B și a monocitelor. TNF crește capacitatea monocitelor de a produce mediatori inflamatori, inclusiv IL-6 și IL-8 (Borish și Rosenwasser, 1996). Figura 11. Evaluarea peptidei de semnal TNF-a. Figura 11 prezintă rezultatele expresiei TNF-α după utilizarea unui sistem de splenocite. 27

După cum era de așteptat, toate tulpinile induc această citokină, deoarece cel mai puternic inductor al acestei citokine din monocite este lipopolizaharidele. Tulpinile MKc059 și Inb001 arată o creștere drastică, spre deosebire de tulpina Inb006, care are cea mai mică inducție. Inducția crescută a citokinei pro-inflamatorii TNF-α poate fi un factor în inducerea inducției excesive a IL-8 și a șocului inflamator în organism, deși nu este o condiție prealabilă pentru niveluri crescute de IL-8. Prin urmare, l-am evaluat în prezența TNF-α pentru a compara cu valorile obținute fără TNF-α și, astfel, pentru a verifica dacă există tulpini care ar putea regla această inducție. Figura 12 prezintă rezultatele măsurării IL-8 și capacitatea unora dintre tulpinile testate de a reduce secreția sa. În portocaliu sunt rezultatele experimentelor de laborator efectuate pe plăci cu un singur godeu cu linie celulară epitelială și stimulate prin adăugarea de TNF-α, iar în galben sunt rezultatele obținute utilizând un sistem conjugat de plăci cu două godeuri cu linii monocite și epiteliale. Figura 12. Evaluarea IL-8 în condiții diferite. 28

un inductor în sinteza proteinelor în reacțiile acute, cum ar fi proteina C-reactivă CRP (Borish și Rosenwasser, 1996). Acest indicator studiat în sângele periferic este monitorizat ca un marker al inflamației. Următoarea figură 13 prezintă rezultatele determinării IL-6. Figura 13. Determinarea IL-6. Din nou, se observă că izolatul DS031 se numără printre tulpinile extrem de induse, care completează profilul său de acțiune pro-inflamatorie. Majoritatea izolatelor studiate au arătat o inducție moderată a acestei citokine, cu valori apropiate de control, iar grupul de izolate intestinale a prezentat în general valori mai mari. Două citokine au efecte predominant antiinflamatorii și acestea sunt IL-10 și TGF-β (factor de creștere transformator-β). Pentru a completa caracterizarea potențialului antiinflamator al tulpinilor, aceste două citokine au fost studiate. IL-10 este produs de multe celule imune și este, de asemenea, cunoscut ca un factor care inhibă sinteza citokinelor. A fost identificat inițial la șoareci la care proliferarea Th1 și producerea interferonului gamma și IL-2 au fost inhibate (Fiorentino și colab., 1998). În studiile ulterioare, activitatea acestei citokine la om a fost de 30

splenocitele sunt de multe ori mai mari decât cele ale liniilor celulare epiteliale și combinate, ceea ce arată puterea diferită a acestor trei modele analitice. Pentru a rezuma rezultatele analizelor citokinelor de bază legate de efectul antiinflamator, am împărțit condiționat tulpinile studiate în grupuri, în funcție de originea lor și în funcție de gradul de inducție - sub și peste valoarea medie pentru fiecare citokină . Rezultatele sintetizate cu numărul de tulpini pe grupe sunt prezentate în următorul tabel 3. Tabelul 3. Numărul de tulpini împărțite în grupuri în funcție de originea lor și de gradul de inducere a citokinei respective, deasupra și sub media. Inducție, citokine LAPTE ACID INTESTINAL pg/ml> Media Miercuri.