spectrofotometric

În chimie, spectrofotometria este măsurarea cantitativă a reflexivității sau a proprietăților de transmisie ale unui material în funcție de lungimea de undă. Spectrofotometria folosește fotometre cunoscute sub numele de spectrofotometre, care măsoară intensitatea unui fascicul de lumină în funcție de culoarea acestuia (lungimea de undă). Caracteristicile importante ale spectrofotometrelor sunt lățimea de bandă spectrală (gama de culori care poate fi transmisă de eșantionul testat), procentul de transmitere a eșantionului, intervalul logaritmic al absorbției eșantionului și, uneori, procentul de măsurare a reflexiei.

Un spectrofotometru este de obicei utilizat pentru a măsura permeabilitatea sau reflexia soluțiilor, solide limpezi sau opace, cum ar fi sticla lustruită sau gazele. Deși multe substanțe biochimice sunt colorate, absorb lumina vizibilă și, prin urmare, pot fi măsurate prin procedee colorimetrice, chiar și substanțele biochimice incolore pot fi adesea transformate în compuși colorați adecvați pentru reacții cromogene de formare a culorilor pentru a obține compuși adecvați pentru analiza colorimetrică. Cu toate acestea, ele pot fi proiectate pentru a măsura difuzitatea intervalelor de lumină listate, care acoperă de obicei aproximativ 200-2500 nanometri, utilizând diferite controale și calibrări. În aceste domenii de lumină, calibrările mașinii sunt necesare folosind standarde care variază în funcție de lungimea de undă a determinării fotometrice.

Utilizarea examen spectrofotometric acoperă diverse domenii științifice, cum ar fi fizica, știința materialelor, chimia, biochimia și biologia moleculară. Acestea sunt utilizate pe scară largă în multe industrii, inclusiv în semiconductori, fabricarea cu laser și optică, tipărirea și testarea criminalistică, precum și în laboratoarele de cercetare chimică. Spectrofotometria este adesea utilizată în măsurători ale activității enzimei, determinarea concentrațiilor de proteine, determinarea constantelor cinetice ale enzimei și măsurarea reacțiilor de legare a ligandilor. În cele din urmă, spectrofotometrul poate determina, în funcție de control sau calibrare, ce substanțe sunt prezente în țintă și cât de exact, calculând lungimile de undă observate.

Examenul spectrofotometric are o mare importanță clinică în aproape toate ramurile medicinii. Capacitatea sa de a măsura concentrațiile substanțelor importante din punct de vedere metabolic în fluidele corpului, cum ar fi sângele, lichidul cefalorahidian, urina și lichidul amniotic, este crucială pentru constatările diagnostice adecvate și monitorizarea continuă a pacienților. De asemenea, deficiențele minore identificate timpuriu în unele substanțe esențiale pot ajuta la prevenirea problemelor de sănătate conexe.

În terapie intensivă, utilizarea analizelor spectrofotometrice este mai frecventă datorită faptului că pacienții aflați în condiții instabile sunt mai susceptibili la modificări drastice ale cantității de diferite substanțe, de exemplu în sângele lor. În acest fel, unitățile de terapie intensivă au adesea spectrofotometre la fața locului, în timp ce medicii de familie își pot trimite sondele la un laborator pentru analize.

Substanțele care pot fi cuantificate prin spectrofotometre sunt numeroase. Acestea includ: hemoglobină, eritrocite, hematocrit, amilază, bilirubină, colesterol, glucoză, uree, creatinină, lipază, trigliceridă, albumină, alcool, amoniac, cupru, magneziu, lactat, calciu, fier, monoxid de carbon, magneziu magneziu, magneziu magneziu. și chiar unele enzime.

Există două clase principale de spectrofotometre:

  • cu un singur fascicul
  • cu o grindă dublă

Spectrofotometrul dual compară intensitatea luminii între două căi de lumină, una conținând o probă de referință și cealaltă o probă de testare. Un spectrofotometru cu un singur fascicul măsoară intensitatea luminii relative a fasciculului înainte și după plasarea probei de testare. Deși măsurătorile de comparație ale instrumentelor cu lumină dublă sunt mai ușoare și mai stabile, fasciculul unic poate avea un interval dinamic mai mare și este optic mai simplu și mai compact. În plus, unele instrumente specializate, cum ar fi spectrofotometrele montate pe microscopuri sau telescoape, sunt instrumente cu un singur fascicul pentru practic.

Din punct de vedere istoric, spectrofotometrele au folosit un monocromator care conține o rețea de difracție pentru a produce spectrul analitic. Grila poate fi detașabilă sau fixă. Dacă se folosește un detector, cum ar fi un tub de focalizare sau o fotodiodă, rețeaua poate fi scanată pas cu pas, astfel încât detectorul să poată măsura intensitatea luminii la fiecare lungime de undă (care corespunde fiecărei „trepte”). De asemenea, pot fi utilizate matrici de detectoare, cum ar fi dispozitive de încărcare conectate sau matrice de fotodiodă. În astfel de sisteme, rețeaua este fixă ​​și intensitatea fiecărei lungimi de undă a luminii este măsurată cu un detector diferit în matrice. În plus, majoritatea spectrofotometrelor cu infraroșu mediu moderne folosesc o tehnică de transformare Fourier pentru a obține informații spectrale. Tehnica se numește spectroscopie în infraroșu Fourier.

Pe scurt, succesiunea evenimentelor din spectrofotometrul modern este următoarea:

  • Sursa de lumină strălucește într-un monocromator, se împrăștie într-un arc și se împarte în două raze. Apoi este scanat prin eșantion și soluțiile de referință.
  • Fracțiile de lungime de undă sunt transmise sau reflectate din probă
  • Lumina rezultată lovește fotodetectorul, care compară intensitățile relative ale celor două fascicule de lumină.
  • Circuitele electronice convertesc curenții relativi în procente de transmisie liniară și/sau valori de absorbție/concentrație.

Pentru dezvoltarea examen spectrofotometric Realizările efectelor fotoelectrice în efectele microscopice și în chimia spectrală joacă un rol semnificativ. Rezultatele coloranților specifici asociați cu structuri biologice strict definite au, de asemenea, un efect benefic. Ulterior, au intrat în practică alți coloranți pentru histone, aminoacizi și proteine. Substanțele fluorescente precum bromura de etidiu, bromura de propidiu și altele intră, de asemenea, în practică. Acești coloranți și reacții permit dezvoltarea de:

  • citofotometrie de absorbție
  • citofotometrie de scanare
  • citofotometrie fluorescentă
  • citofotometrie în flux

Citofotometria de absorbție folosește reacțiile citochimice ale celulei cu produsele colorante. Se bazează pe principiul absorbției unei părți a luminii care trece prin celulă sau mediul lichid. Fascicul de lumină al undei are o lungime de undă în spectrul vizibil. Prin urmare, lumina absorbantă și lumina care trece prin obiect vor depinde de densitatea sa optică, adică va depinde de concentrația substanței testate. Rezultatul obținut, reflectând cantitatea de substanță, este înregistrat în unități de lucru. Acestea sunt reprezentate pe o histogramă bazată pe sistemul de coordonate.

Citofotometria de absorbție se realizează cu preparate histologice sau citologice de rutină colorate prin metoda Fölgen. Măsurarea densității optice poate fi efectuată în mai multe moduri, în funcție de tipul de preparat. Densitatea celulelor, forma și dimensiunea lor, intensitatea lor de colorare, precum și fundalul de colorare sunt importante. Sunt recunoscute următoarele metode de examinare:

  • măsurarea întregului obiect - utilizat pentru nuclee de aceeași formă și dimensiune
  • metoda de înfundare - preferată în special pentru secțiunile histologice
  • modul multi-dop - măsoară mai mult de o zonă din miez folosind o deschidere mică
  • modul cu un singur plan cu două planuri - folosește principiul modului plug
  • modul cu dublă undă - una dintre cele mai consumatoare de timp

Citofotometria de scanare se bazează pe metoda de examinare prin plug, măsurând în mod sistematic fotometric un număr mare de puncte din întregul nucleu. Se obțin o informație mai bogată - optică și geometrică. Se obțin informații despre modificările structurii cromatinei nucleelor, în diferite condiții funcționale și patologice ale celulei. Distribuția cromatinei în nucleu pentru anumite specii este constantă. Orice creștere sau scădere a funcției celulare va afecta nivelul ambelor cromatine.

Citofotometria fluorescentă se bazează pe reacția de legare a fluorocromului cunoscut la o structură celulară specifică. Lumina emisă de obiectul fluorescent are o lungime de undă diferită de cea care a excitat fluorescența. Dar și aici este nevoie de un standard. Celulele de referință cu valori ADN cunoscute au fost aplicate la o secțiune a preparatului de testare.

În citofotometria în flux se folosește material proaspăt sau congelat. Fluorocromii sunt, de asemenea, utilizați în această metodă. Dar, spre deosebire de alte metode, acesta folosește un material sub forma unei suspensii celulare. Fiecare celulă trece prin focalizarea optică a dispozitivului. Fluorescența sa este transformată într-un semnal electric. Toate semnalele sunt aranjate în canale strict definite în funcție de puterea fluorescenței. Rezultatele sunt înregistrate pe o histogramă.