Linlin Bao, Wei Deng, Hong Gao, Chong Xiao, Jiayi Liu, Jing Xue, Qi Lv, Jiangning Liu, Pin Yu, Yanfeng Xu, Feifei Qi, Yajin Qu, Fengdi Li, Zhiguang Xiang, Haisheng Yu, Shuran Gong, Mingya Liu, Guanpeng Wang, Shunyi Wang, Zhiqi Song, Wenjie Zhao, Yunlin Han, Linna Zhao, Xing Liu, Qiang Wei, Chuan Qin

Boala Coronavirus 2019 (COVID-19), cauzată de Sindromul respirator acut sever al Coronavirus - 2 (SARS-CoV-2, engleză: SARS-CoV-2) are originea în provincia Wuhan, China și-a continuat răspândirea în Coreea de Sud, Japonia, Italia și Iran. Peste 90.000 de persoane sunt infectate în întreaga lume, cu aproape 3.000 de decese în aproximativ 40 de țări 1.2. Începând din februarie, cazurile de pacienți externați în provincia Guangdong și în alte părți care au dat rezultate pozitive și au trebuit spitalizați pentru urmărire au fost estimate la aproximativ 14% 3,4. Suspiciunile asupra unui risc de recurență și re-infecție după recuperarea de la infecția inițială sunt de interes global. Prin urmare, în acest studiu, am folosit exemple de infecție cu SARS-COV-2 la primate neumane urmate de re-expunere la același virus pentru a determina probabilitatea de reinfecție.

Pentru urmărirea longitudinală a fiecărei maimuțe, anticorpii specifici SARS-CoV-2 la maimuțele M2, M3 și M4 au fost semnificativ crescute în zilele 14, 21 și 28, comparativ cu zilele 3 și, respectiv, 7. I day dpi (* P 5)

rhesus

Patru maimuțe au fost inițial expuse la 1 × 106 TCID50 SARS-CoV-2 prin metoda intratraheală. Pentru a investiga efectul re-infecției după recuperare, M3 și M4 au fost expuse la aceeași doză de SARS-CoV-2 în ziua 28 după infecție (dpi). Două dintre animale (M1 și M3) au fost eutanasiate în zilele 7 și 5, respectiv, după reexpunere (dpr). M2 cu infecție unică și M4 cu infecție primară urmată de expunere secundară au fost monitorizate longitudinal pe parcursul perioadei de urmărire. Greutatea corporală, temperatura și tampoanele nazale/gât/anale au fost monitorizate la intervale scurte de timp, conform unui program. Două măsurători ale răspândirii virusului și ale histopatologiei (colorare HE/IHC) au fost făcute în ziua 7 dpi (M1) și ziua 5 dpr (M3). Anticorpii specifici împotriva SARS-CoV-2 au fost detectați de șapte ori și radiografia a fost efectuată de 3 ori.

(A și b) Semne clinice la fiecare maimuță. Modificări ale greutății corporale și ale temperaturii rectale au fost înregistrate zilnic în conformitate cu programul după infecția inițială și re-expunerea ulterioară la virus. Greutatea este reprezentată ca procent din greutatea corporală înainte de infecție.

(c, d și e) Nivelurile de ARN viral găsite în tampoane nazale, tampoane de gât și tampoane anale. SARS-CoV-2 ARN a fost detectat prin qRT-PCR de tampoane de la cele patru maimuțe la momentele adecvate. Două maimuțe au fost expuse din nou virusului în ziua 28 dpi (linie întreruptă)

(f) Detectarea ARN-ului viral în organele majore precum creierul, ochii, nasul, faringele, plămânii și intestinele. Comparativ cu M1 cu infecție inițială în ziua 7 dpi, testele de replicare virală în țesuturile respective la M3 (ziua 5 dpr) după re-expunere au fost negative.

(g) Niveluri de IgG specifice în raport cu proteina spike la fiecare maimuță. Nivelurile de antigen viral IgG specific de la fiecare maimuță au fost găsite la 3, 7, 14, 21, 28 zile dpi. Nivelurile de IgG specifice din dpi-urile 14, 21 sau 28 sunt semnificativ mai mari decât cele din dpi 3-a sau a 7-a zi. Liniile gri ilustrează media pentru toate animalele din acel moment. (ANOVA cu sens unic, * P

(A) Histopatologie și studii imunohistochimice ale plămânilor maimuței M1 (a 7-a zi dpi) și a maimuței M3 (a 5-a zi dpr). Examenul histopatologic a arătat pneumonie interstițială moderată cu infiltrare de limfocite (săgeată verde) și macrofage alveolare umflate (săgeată roșie) în cavitățile alveolare în ziua 7 dpi. Antigenele SARS-KoV-2 au fost detectate cu anticorpi anti-Spike prin imunohistochimie. Scală: Bara neagră = 100 µm, bara roșie = 50 µm

S-a raportat că nivelurile ridicate de anticorpi neutralizanți au un efect protector împotriva infecției cu SARS-CoV, dar nivelurile scăzute de anticorpi neutralizanți sunt mai susceptibile și pot exacerba infecția cu SARS-CoV, provocând efectul intrării facilitate a anticorpilor în celula gazdă ( ADE). După cum se vede în Tabelul 1, titrurile de 1,16 (M2, M4) și 1,8 (M3) prezintă un efect neutralizant la 21 și 28 dpi. După re-expunere, titrurile M4 au crescut în ziua 5 dpr și ziua 14 dpr, în timp ce cele de pe M3 au rămas la 1,8 în ziua 5 dpr. În acest studiu, nu s-a găsit ADE la maimuțele infectate care au fost apoi expuse la SARS-CoV-2. Deoarece anticorpul neutralizant din studiile noastre pe animale este similar cu cel la pacienții recuperați, aceste rezultate vor fi importante în evaluarea dezvoltării vaccinului.

Tabelul 1: Titruri cu anticorpi neutralizanți care protejează maimuțele infectate cu SARS-CoV-2 de reinfecție.

Metode utilizate:

Etică

Patru macaci rhesus în vârstă de 3 până la 5 ani, numiți M1 până la M4, au fost găzduiți și îngrijiți într-o instalație acreditată de Asociația pentru evaluarea și acreditarea îngrijirii animalelor de laborator (AAALAC). Toate procedurile și experimentele legate de animale au fost efectuate în conformitate cu regulile aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) al Institutului de științe animale de laborator, Academia Chineză de Științe Medicale (BLL20001). Toate animalele au fost anesteziate cu clorhidrat de ketamină (10 mg/kg) înainte de eșantionare și experimentele au fost efectuate într-un laborator de nivel 3 de biosecuritate animală (ABSL3).

Experimente pe animale

La infecția inițială, toate animalele au fost injectate intratraheal cu virusul SARS-CoV-2 disponibil (SARS-CoV-2/WH-09/uman/2020/CHN izolat în laboratorul nostru), la o doză de 10 6 TCID50/1 ml a soluției. După recuperare, M3 și M4 au fost re-expuse intratraheal cu aceeași doză (10 6 TCID50/1 ml) de SARS-CoV-2 în ziua 28 dpi. Pentru a confirma răspândirea virusului și modificările patologice, M1 și M3 au fost eutanasiate și autopsiate în ziua 7 dpi și ziua 33 dpi (ziua 5 dpr), respectiv. Toate animalele au fost monitorizate în timpul studiului pentru a înregistra greutatea corporală, temperatura corpului, semnele clinice, tampoane nazale/gât/anale, raze X și anticorpi specifici. Experimentul pe animale și programul de prelevare longitudinală sunt prezentate în Figura 1.

Cuantificarea ARN-ului SARS-CoV-2

Probele de tampoane nazale/gât/anale și țesuturi bazale colectate de la maimuțele infectate au fost testate pentru SARS-CoV-2 ARN prin transcriere cantitativă în timp real-PCR (qRT-PCR). Tot ARN-ul a fost recuperat și transcris invers după cum este descris în articolul 7 de mai sus. Reacțiile qRT-PCR au fost efectuate într-un sistem ABI 9700 PCR în timp real (Instrumentul Biosystems Aplicat), cu un protocol pentru secvențierea temperaturii ADN-ARN prin PCR la: 50 ° C timp de 2 minute, 95 ° C timp de 2 minute, urmat cu 40 de cicluri la 95 ° C timp de 15 sec. și 60 ° C timp de 30 sec, apoi 95 ° C timp de 15 sec, 60 ° C timp de 1 min, 95 ° C timp de 45 sec. Exemplu direct: 5′-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3 ’, Exemplu invers: 5′-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’.

ELISA

Serurile au fost colectate de la fiecare animal pentru a măsura anticorpii SARS-CoV-2 printr-un test imunosorbent legat de enzime (ELISA) conform unui program de testare după infecția inițială. Plăcile cu 96 de godeuri au fost acoperite cu 0,1 μg de proteină S (receptor ACE2) din SARS-CoV-2 (Sino Biological, 40591-V08H) și peste noapte la 4 ° C și blocate cu 2% BSA/PBST timp de 1 oră la cameră temperatura. S-au adăugat 1: 100 de probe diluate în fiecare godeu și s-au lăsat să stea timp de 30 de minute la 37 ° C, urmate de adăugarea de anticorpi umani HPR IgG Anticorp (Beijing ZSGB Biotechnology, ZB-2305), incubate timp de 30 de minute la temperatura camerei, Reacția a fost dezvoltată din substrat TMB și determinată la 450 nm.

Histopatologie și imunohistochimie

Autopsiile au fost efectuate conform protocolului standard în ABSL3 de laborator, în ziua 7 dpi pentru M1 și ziua 5 dpr pentru M3. Probele de plămâni au fost fixate în soluție de formalină cu tampon neutru 10%. Secțiunile de parafină (3-4 μm grosime) au fost apoi preparate și colorate cu hematoxilină și eozină (H&E) înainte de a fi observate prin microscopie cu lumină. Pentru identificarea antigenelor SARS-CoV-2 prin colorare imunohistochimică (IHC), regiunile deshidratate de parafină (3-4 μm grosime) au fost tratate cu un kit de recuperare a antigenului (Boster, AR0022) timp de 1 minut la 37 ° C și au fost tratate cu peroxidaze endogene în 3% H202 în metanol timp de 10 minute. După fixarea în ser normal de capră 1% timp de 1 oră la temperatura camerei, piesele au fost colorate cu anticorp monoclonal 7D2 (martor de laborator 7) la 4 ° C peste noapte după incubarea anticorpilor HPR umani cu anticorp IgG murin (Beijing ZSGB). Biotehnologie, ZDR-5307) timp de 1 oră. Apoi, bucățile, feliile au fost tratate cu tetrahidroclorură de 3,30-diaminobenzidină (DAB) și imaginea a fost examinată la microscopul Olympus.

Test pentru neutralizarea anticorpilor

Probele de ser au fost testate pentru prezența anticorpilor neutralizanți observați pentru efecte citopatice (CPE). Pe scurt, serurile de maimuță au fost inactivate termic la 56 ° C timp de 30 de minute. Apoi, serurile diluate în serie au fost incubate cu 100 TCID50 SARS-CoV-2 timp de 1 oră la 37 ° C și adăugate la celulele Vero-E6 într-un ELISA cu 96 de godeuri. Celulele au fost cultivate timp de 1 săptămână în căutarea CPE și s-a calculat diluția serică, în care 50% din celule au fost protejate de infecție. Fiecare diluție serică a fost testată în triplicat.

analize statistice

Comparația dintre grupuri a fost determinată folosind ANOVA unidirecțional. Toate datele au fost analizate cu software-ul GraphPad Prism 8.0. Nivelul stabilit de semnificație statistică este * p